在運(yùn)用ELISA方法測定抗體方面,通常所用的方法稱為間接法,也是目前zui常用的方法,其原理:間接法首先用抗原包被于固相載體,這些包被的抗原必須是可溶性的,或者至少是極微小的顆粒,經(jīng)洗滌,加入含有被測抗體之標(biāo)本,再經(jīng)孵育洗滌后,加入酶標(biāo)記抗抗體,(對人的標(biāo)本來說即加酶標(biāo)抗人球蛋白IgG、IgM),再經(jīng)孵育洗滌后,加底物顯色,底物降解的量,即為欲測抗體的量,其結(jié)果可用目測或用分光光度計定量測定。
操作步驟:
1.將抗原按5 μg/ml稀釋于碳酸鹽緩沖液(pH 9.6),100 μl /孔,4℃過夜。
2.次日PBS-T清洗4次(快1慢3,間隔5分鐘)。
3.加2%BSA封閉室溫1 h,200 μl /孔。
4.陽性對照從10ug/ml,做倍必稀釋,待測血清從1:50做倍比稀釋,預(yù)試驗(yàn)后確定稀釋倍數(shù)及陽性對照的起始濃度及稀釋數(shù)量(以可以做標(biāo)準(zhǔn)曲線為參數(shù)),室溫1h。
5.PBS-T清洗4次(快1慢3,間隔5分鐘)。
6.加入1:3000(不同公司有不同的推薦稀釋度) PBS-T稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗人IgG,100 μl /孔,室溫1h。
7.PBS-T清洗4次(快1慢3,間隔5分鐘)。
8.顯色,100 μl /孔,顏色變深后中止顯色,2M硫酸在BIO-RAD酶標(biāo)儀上讀數(shù),可用ABTS,OPD,TMB等
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