型 號(hào)
產(chǎn)品時(shí)間2023-11-05
所屬分類糖異生系列
報(bào)價(jià)300
產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 | 貨號(hào) |
磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)生化檢測(cè)試劑盒 | 100管/96樣 50管/48樣 | EY-01S1373 |
測(cè)定意義:
PEPCK(EC 4.1.1.32)廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和細(xì)胞中,催化草酰乙酸轉(zhuǎn)化為磷酸烯醇式丙酮酸,是調(diào)節(jié)糖異生途徑的關(guān)鍵酶。
測(cè)定原理:
PEPCK催化草酰乙酸生成磷酸烯醇式丙酮酸和CO2,丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶進(jìn)一步依次催化NADH氧化生成NAD+,在340nm下測(cè)定NADH下降速率,即可反映PEPCK活性。
需自備的儀器和用品:
分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。
試劑一:液體×1瓶,室溫保存。
試劑二:液體×1瓶,4℃保存。
試劑三:粉劑×2瓶,-20℃保存。臨用前加入22mL試劑二,現(xiàn)配現(xiàn)用。
試劑四:液體×1支,4℃保存。
1、組織:按照組織質(zhì)量(g):試劑一體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一)進(jìn)行冰浴勻漿。16000g,4℃離心20min,取上清置冰上待測(cè)。
2、細(xì)菌、真菌:按照細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):試劑一體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL試劑一),冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時(shí)間3min);16000g, 4℃離心20min,取上清液置冰上待測(cè)。
3、血清等液體:直接測(cè)定。
(1)按照蛋白濃度計(jì)算
活性單位定義:25℃中每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol NADH 為1個(gè)酶活單位。
ADH (nmol/min/mg prot) =(△A÷ε÷d×V反總×109) ÷(Cpr×V樣)÷T
=1608×△÷Cpr
(2)按照樣本質(zhì)量計(jì)算
活性單位定義:25℃中每克組織每分鐘氧化1nmol NADH 為1個(gè)酶活單位。
ADH (nmol/min/g鮮重) =(△A÷ε÷d×V反總×109) ÷(W×V樣÷V樣總)÷T
=1608×△A÷W
(3)按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
活性單位定義:25℃中每104個(gè)細(xì)胞每分鐘氧化1nmol NADH 為1個(gè)酶活單位。
ADH (nmol/min/104cell) =(△A÷ε÷d×V反總×109)÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T
=1608×△A ÷細(xì)胞數(shù)量
(4)按液體體積計(jì)算
活性單位定義:25℃中每毫升血清每分鐘氧化1nmol NADH 為1個(gè)酶活單位。
ADH (nmol/min/mL) =(△A÷ε÷d×V反總×109) ÷V樣÷T
=1608×△A
ε:NADH摩爾消光系數(shù),6.22×103L/mol/cm;d:比色皿光徑,1 cm;V反總:反應(yīng)體系總體積,1000μL=0.001 L;Cpr:上清液蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;V樣:加入反應(yīng)體系中上清液體積,100μL=0.1 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,1min。
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